Я шкодую, що не є конспірологом і не зловживаю клікбейтом, оскільки цей заголовок максимально точно описує прикру реальність. Технологію генної терапії на основі аденоасоційованого вірусу «покращили» точним точковим мутагеном (base editor), проігнорували загибель піддослідних макак від надмірної імунної реакції та довели до смерті дитину, яка, можливо, навіть не потребувала цієї терапії. А потім почали замітати сліди. Опублікували статтю в Nature про те, як успішно працює їхня система на мишах і макаках. Про дитину, звісно, — анічичирк. Класична Китайська Народна Республіка.
Це — якщо коротко. Але ми тут полюбляємо детальні розбори, еге ж?
Почнімо з того, що сьогодні генна терапія — вже не наукова фантастика, а цілком регулярна і регламентована медичними протоколами процедура. Щоправда, процедура, не позбавлена ризику. Летальні випадки, звичайно, є одиничними, і кожен дуже детально вивчається, але різний ступінь гепатотоксичності та надмірні імунні реакції трапляються регулярно. Як правило, ці прояви можна ефективно подолати. А сама процедура дає шанс на повноцінне життя дітям із рідкісними, але важкими генетичними вадами — такими, як спінальна м’язова атрофія (заміщення гена SMN1, затверджено в 2019 році) або вроджена сліпота (амавроз) Лебера (заміщення гена RPE65, затверджено в 2017 році)1.
Усі наведені приклади належать до моногенних генетичних захворювань, коли за патологію відповідає лише один конкретний відомий ген, і часто — заміна одного-єдиного нуклеотида в ньому. Таких недуг — меншість, але саме проти них найкраще працює генна терапія. Всього буває три стратегії терапії: 1) заміщення — коли вноситься додатковий ген, що перебирає на себе функцію мутованого; 2) інтеграція — коли робочу копію вставляють у геном клітини, щоб вона не губилася під час клітинних поділів; 3) замовчування — коли певний ген шкодить і його треба позбутися (надалі про третю стратегію не йтиметься). Ще є теоретична та омріяна четверта стратегія, яку досі не вдалося реалізувати і яка стала центром сьогоднішньої драми: корекція — коли змінюється послідовність самого мутованого гена прямо в геномі клітин2.
Зазвичай перевагу віддають саме замісній терапії, коли в клітину просто доставляють робочу копію гена, яка працює замість поламаної. Це роблять без вбудовування в клітинну ДНК, щоб запобігти випадковому мутагенезу. Щоправда, такий підхід працює лише з клітинами, які довго живуть і функціонують (наприклад, нейронами або клітинами печінки). Для клітин-попередників кровотворення (гемопоетичних клітин), які постійно діляться, він не підходить, оскільки додана ДНК швидко втрачається під час клітинних поділів — там якраз потрібна стабільна інтеграція3, яку виконують : забирають гемопоетичні клітини, модифікують за допомогою лентівірусного вектора (Lyfgenia)4, перевіряють вставку й повертають назад пацієнту. Так лікують, наприклад, серповидну клітинну анемію.
Що таке серповидна клітинна анемія й чому про неї варто знати?
Та зосередимося на найбільш поширеній і надійній замісній терапії. Як доправити ДНК всередину наших клітин? У природі існує дуже ефективний механізм — віруси! З погляду безпеки, щоб претендувати на посаду вектора для генної терапії, кожен вірус має задовольняти кілька вимог. Зрозуміло, що він має бути непатогенним для людини (або позбавленим здатності викликати захворювання)5. Але водночас вірус має бути максимально непомітним для імунної системи відразу з двох причин: 1) суто технічно, якщо навантажені корисною ДНК частинки буде знищувати імунна система, то ніякого геномного редагування не буде; 2) в організм пацієнта вводять трильйон векторних частинок, і якщо вірус запустить надмірну імунну реакцію, то вона може швидко вийти з-під контролю і завдати хворому непоправної шкоди6. Також віддають перевагу вірусам, які не вбудовуються в геном клітини, адже в намірі полагодити один ген бажано було б не пошкодити інший5. І, звісно, беруть до уваги специфічність до клітин (тропізм), які треба модифікувати. Із тропізмом вірусів можна працювати за допомогою генетичної інженерії7. Найпоширенішими побічними ефектом генної терапії є токсичність для печінки, оскільки векторні частинки мають тенденцію осідати саме в нашому нашому природному кровʼяному фільтрі. До того ж сила реакції з боку печінки залежить від генетичних та індивідуальних особливостей пацієнта, тому її неможливо спрогнозувати наперед8.
Генна терапія, якою ми її знаємо (із введенням вірусних векторів у кровотік людини), почалася з генетично інактивованих аденовірусів9. Це одна з найдавніших гілок еволюції дволанцюгових ДНК-вірусів — реалм (надцарство) Varidnaviria, які інфікують всі клітинні організми на Землі, тобто є еволюційно давніми10, 11. У бактерій вони представлені граційними тектівірусами, у амеб та одноклітинних водоростей — гігантськими ДНК-вірусами. У нас далекими родичами гігантських ДНК-вірусів є збудник натуральної віспи. А також із цієї групи нас інфікують аденовіруси — збудники різноманітних застуд (AdV-B, -C, -E), конʼюнктивітів (AdV-C, -D), захворювань сечовивідної системи (AdV-B) та кишково-шлункового тракту (AdV-A, -F, -G)12.
Для генної терапії аденовіруси привабливі з кількох причин: їх порівняно легко виробляти у великих кількостях, вони здатні переносити великі генетичні вставки, надзвичайно ефективно проникають у клітини та не вбудовуються в їхній геном. Але є серйозний недолік. Саме через те, що ці віруси такі древні, в нашої імунної системи є вроджені механізми розпізнавання їхніх , тому вона реагує гостро й потужно7.
Це стало причиною смерті Джессі Ґелсінґера у вересні 1999 року, що було першим подібним випадком. Джессі страждав від часткової недостатності орнітин-транскарбамілази (ОТК) — ферменту, що бере участь у циклі сечовини, тобто процесі знешкодження аміаку в печінці. Вроджена форма цього захворювання у немовлят майже завжди летальна. Проте Джессі мав мозаїчну форму, тобто частина його клітин не мала мутацій, і він жив на суворій дієті та медикаментах13. Його стан був стабільним — він прийшов у дослідження добровільно, щоб допомогти розробити майбутнє лікування для дітей із повною недостатністю ферменту14.
Протокол передбачав введення в печінкову артерію аденовірусного вектора, який ніс робочу копію гена ОТК. На перший погляд мішень здавалась ідеальною: відома мутація у гені із чітко визначеною біохімічною функцією. На додачу, накопичення векторних частинок в печінці не було проблемою, адже саме цей орган був ціллю генної терапії. Але, на жаль, системна імунна реакція із неконтрольованим запаленням відразу після введення препарату призвела до ураження всього організму, множинної та смерті13. Сьогодні аденовіруси не використовуються як вектори у генній терапії. Проте їхні імуногенні властивості знайшли застосування в іншій галузі — розробці вакцин, якраз там, де треба максимально стимулювати імунну систему15.
Заміна аденовірусам знайшлася швидко і майже випадково. Ними стали аденоасоційовані віруси (AAV) із крихітним (25 нанометрів) капсидом і компактним (всього 4,7 тисячі пар нуклеотидів, тоді як у аденовірусів — 30–40 тисяч)16 одноланцюговим ДНК-геномом. Їх відкрили, коли намагалися очистити аденовіруси, і спочатку подумали, що препарат був забруднений іншим вірусом. Але пізніше виявилося, що це паразит паразита, який сам, без аденовірусу, розмножуватися не здатен17. Найголовніше, що аденоасоційовані віруси можуть входити в людські клітини, але не викликають жодних захворювань. Проте залишаються проблеми імуногенності, оскільки багато людей мають проти них антитіла, і гепатотоксичності в разі системного введення. Іншим суттєвим обмеженням є маленький капсид, здатний пакувати до 5 тисяч нуклеотидів корисного навантаження (це не надто багато)1.
Існує із півтора десятка природних (AAV1–AAV13), які відрізняються капсидними білками — і, відповідно, тропізмом: здатністю вибірково проникати в певні тканини. Наприклад, AAV2 ефективно переносить клітини сітківки ока, AAV6 — легеневий епітелій, а AAV9 здатен долати і проникати в центральну нервову систему18. Також відомі мавпячі AAV (наприклад, AAVrh.74) які є дуже привабливими для генної терапії, адже проти них у людей немає антитіл.
Для лікування спінальної м’язової атрофії, згаданої на початку, якраз застосовують нейротропний AAV9. Препарат називається Zolgensma (фірма Novartis), його річні продажі наразі перетнули позначку 1 мільярд доларів19. Його системно вводять у кровотік новонародженим, у яких виявлена мутація гену SMN1. Далі вірус долає гематоенцефалічний барʼєр і потрапляє в мотонейрони спинного мозку, де починається експресія робочої копії гену SMN1. Оскільки нейрони не діляться, додаткова ДНК зберігає свою функцію десятиліттями, і дитина розвивається з нормальною руховою активністю1.
Нещодавно також затвердили варіант генної терапії для дорослих людей під комерційною назвою Itvisma. Дорослі люди, очевидно, мають більшу масу тіла, ніж новонароджені, і тому потребують введення більшої кількості вірусних векторів. Проте тут дається взнаки гепатотоксичність AAV9, тому їм вірус вводять безпосередньо у спинномозкову рідину. Так вдається досягти мотонейронів напряму, оминаючи печінку і значно знижуючи токсичність20.
Це був приклад успішного застосування замісної генетичної терапії. Варто зазначити, що подібним способом також наразі лікують сліпоту Лебера та гемофілію1.
Перш ніж ми перейдемо до того, що накоїли китайські вчені, — кілька слів про геномне редагування, що має потенціал стати основою саме для корекційної стратегії генної терапії. Наразі ця галузь активно розвивається, та поки що немає жодного затвердженого препарату, який би здійснював корекцію гена прямо в організмі людини. Зміни в геном (але не в конкретний ген) клітин вносяться лише в ex vivo терапії клітин кровотворення, які ми побіжно згадували.
У 2000-х, коли все тільки починалося, єдиним способом виправити несправний ген була гомологічна рекомбінація: правильну ДНК доставляли у клітину (так само, як у замісній терапії), а далі клітинні ферменти самі повинні були вписати її замість неправильної. Ключем до специфічності є ідентичні послідовності навколо мутації, які містяться як у цільовому гені, так і в генетичному конструкті. Оскільки переписування починається на ідентичних ділянках, цей процес отримав назву «гомологічна рекомбінація». Вона є вкрай неефективною, оскільки клітинні ферменти не переписують усе підряд: їм потрібен стимул у вигляді пошкодження ДНК, а саме розриву обох ланцюгів. Коли ферменти намагаються його виправити, вони активно шукають резервну копію, якою зазвичай слугує сестринська хроматида (нагадаю, що ми диплоїдні організми, тож вся наша ДНК зберігається у двох копіях — хоча це не зовсім копії, а алелі, та наразі це не принципово). У потенційній генній терапії замість сестринської хроматиди ми можемо підсунути ферментам синтетичну ДНК, щоб виправити мутацію. Проте розрив ДНК саме у потрібному нам місці є випадковим процесом. До того ж гомологічна рекомбінація найбільш активна лише під час певної стадії клітинного циклу, коли синтезується нова ДНК. Саме тому таке виправлення загалом є вкрай неефективним21.
Ситуація разюче змінилася із появою CRISPR/Cas-систем у 2010-ті роки. Це бактеріальні імунні , які каталізують дволанцюгові розриви ДНК у вірусних генах, захищаючи бактерію від інфекції. Найголовніше, що для пошуку чужорідних генів вони використовують принцип комплементарного парування азотистих основ — найбільш специфічний метод наведення на ДНК-послідовність, який тільки можна уявити22. Тепер не треба чекати на пошкодження ДНК навколо небажаної мутації: його там можна спровокувати. До того ж ця бактеріальна система чудово працює і в наших клітинах в контексті цілого організму, тому вона отримала назву «геномне редагування». Плюс до ефективності, але мінус до безпеки, бо точність хоч і висока, але не стовідсоткова. Тому можуть виникати так звані позацільові ефекти (off-target effects)21.
Через це з’явилися наступні покоління геномного редагування, які не передбачають внесення дволанцюгових розривів у нашу ДНК. Їх отримали шляхом інактивації нуклеазного домену Cas і пришивання до нього інших ферментів. Тобто нуклеазу позбавили основної функції і закріпили за нею тільки функцію наведення на ДНК. Наразі існують дві основні системи надточного геномного редагування: 1) аденозинові та цитозинові «виправлялки» азотистих основ (base editors), які можуть чітко замінити одну букву в ДНК за допомогою деаміназної активності пришитого до Cas ферменту23; 2) prime editing — переписувач, який може полагодити невеличку секцію ДНК у 50 нуклеотидів, тому йому до снаги не лише точкові мутації, а й інсерції та делеції (зайві чи відсутні нуклеотиди)24.
Усі ці системи дуже добре працюють у культурах клітин та зиготах лабораторних тварин і активно використовуються для створення різноманітних мутантів для дослідження функцій генів. Питання на мільйон (навіть, мабуть, на кілька мільярдів): як загорнути ці системи у правильну обгортку, щоб виправляти мутації безпосередньо в організмі людини? Саме цю проблему надто квапилися вирішити китайські вчені. Подальша дискусія заснована на викривальній публікації в журналі Science25 та їхній статті в Nature26.
І їм підвернувся ідеальний «об’єкт дослідження» — дівчинка із синдромом Снайдерса Блок–Кампо. Причиною цієї недуги є зміна одного нуклеотиду в гені CHD3, який відповідає за регуляцію експресії генів в нейронах. Це дуже рідкісний розлад, що проявляється як затримка мовного і рухового розвитку, когнітивні труднощі та риси аутистичного спектра. Хвороба не є летальною і не прогресує: пацієнти живуть, але їхнє відставання від однолітків поступово стає помітнішим. Сила прояву суттєво відрізняється в окремих випадках: деякі такі люди цілком можуть функціонувати у суспільстві. У дівчинки якраз була легша форма захворювання.
Команда під керівництвом Цзілонга Цю розробляла вектор для редагування геному на основі AAV9. Він складався із CRISPR-редактора аденінових азотистих основ та РНК, що націлювала систему на мутацію в гені CHD3. Через те, що розміри такої системи чималі, а місткість AAV9 обмежена, довелося розділити її на два вектори, тобто для доставки всієї системи потрібно було вдвічі більше вірусних частинок.
Доклінічні результати здавалися переконливими. Команда Цю створила мишачу модель із гуманізованим геном CHD3, що ніс відому мутацію. Мутантні мишенята демонстрували риси, характерні для нейророзвиткових порушень: менше пищали під час відлучення від матері — класичний маркер соціальної дисфункції у гризунів — і показували гірші результати в тестах на пізнання та моторику. Після введення геномного редактора через систему двох AAV-векторів мутація зникала, рівень білка CHD3 відновлювався, а поведінкові аномалії зникали. На макаках було продемонстровано, що двокомпонентного вектора веде до широкого охоплення нервової тканини та активної роботи редактора азотистих основ в нейронах.
Незабаром дівчинка отримала міжхребцеву інʼєкцію. Спочатку в неї була типова реакція на введення вірусного вектора із підвищеною температурою та реакцією печінки. Проте симптоми не минули, а після того, як дівчинка перестала ходити в туалет, лікарі збагнули, що в неї відмовляють нирки. Її терміново перевели до інтенсивної терапії, але наступного ранку вона вже не прокинулася. призвів до мікротромбозу капілярів і, по суті, зупинки кровообігу.
Причини такої гіперімунної відповіді наразі невідомі. Це могла бути індивідуальна реакція як на вірус, так і на компоненти препарату. Затверджені протоколи генної терапії на основі аденоасоційованих вірусів містять лише ДНК, а тут були білки-редактори азотистих основ, які цілком могли спричинити реакцію. Ця можливість не була достатньо досліджена. В однієї з двох піддослідних макак спостерігали реакцію нирок, яка могла бути викликана мікротромбозом, але в дослідженні ця тема не розкрита.
Так само, як і у випадку із Джессі Ґелсінґером, тут дається взнаки очевидний поспіх із впровадженням технологій. Тоді мотивом було особисте зацікавлення керівника досліджень, власника частки компанії Genovo, яка напряму фінансувала це клінічне дослідження27. Тут же, окрім фінансової складової, може бути ще й ідеологічна. Уявіть: Китай — перша в світі країна, де успішно здійснено терапевтичне in vivo редагування геному людини!
Щось подібне було із народженням у Китаї дівчат-близнючок, яким вибили ген CCR5, начебто щоб вони не підхопили вірус СНІДу від своєї ВІЛ-позитивної матері. У цьому насправді не було ніякої потреби, адже проста антиретровірусна терапія протягом вагітності та пологів знижує ризик зараження дітей до менш ніж одного відсотка. І хоч китайська влада тоді офіційно засудила вчинок свого науковця, Хе Янкуя, і посадила його за ґрати на три роки28, Китай тепер назавжди — перша країна в світі, де народилися генномодифіковані люди.
Як Китай перемагає у битві за редагування геномів
У випадку із синдромом Снайдерса Блок–Кампо генна терапія так само була надмірним рішенням, оскільки, на відміну від спінальної м’язової атрофії (яку й так вже успішно лікують без генно-редакційних вивертів), він не є летальним і навіть піддається корекції. Свого часу відомий всім так званий «союз» задля першості доводив до смерті космонавтів, а китайці проводять експерименти над дітьми. Такі вони «цікаві» — людожерські комуністичні режими.
