Уявіть, що у вас є купка клітин, які потрібно порахувати, посортувати чи з’ясувати, до якого типу вони належать. Навіть за наявності мікроскопа і фотороботів всіх видів клітин це завдання не з легких: у зразку таких клітин сотні тисяч, впізнати кожну займе страшенно багато часу, а розділити їх окремо буде значно складніше, ніж Попелюшці перебрати просо й мак. З таким надскладним завданням науковцям та медикам допомагає впоратись протокова цитометрія. Як дзеркала та лазери дозволяють ідентифікувати клітину? Для чого підфарбовувати клітини? Як змусити їх шикуватись, наче на уроці фізкультури? Про все це дізнаємось у статті.
Що таке протокова цитометрія
На першій лекції з органічної хімії викладач жартівливо вчив нас вимовляти без запинки «циклопентанпергідрофенантрен», щоб з перших днів навчання можна було вразити знайомих чи рідних. Чи допомагає мені в дорослому житті це слово? Ні. Зате допомагає книжка Рендала Манро Thing Explainer, яка пояснює складні речі за допомогою лише 1000 найпоширеніших англійських слів. Жодного терміну і принцип роботи мікрохвильовки, атомної електростанції, тектонічних плит, ракет, пральних машин.
Розуміння роботи приладів значно цінніше, ніж вміння сипати складними термінами. Воно дозволяє не лише знайти спільну мову з абсолютно різними людьми, а й полагодити побутові речі, а ще отримати неймовірне задоволення, коли пазл складається і ти нарешті розумієш, як воно працює. Тому в цій статті хочу розповісти про протокову цитометрію — неймовірно захопливий метод дослідження клітин.
Протокова цитометрія — це метод аналізу групи клітин або частинок, який на основі даних про розмір, щільність внутрішніх структур (зернистість), та унікальних маркерів на поверхні клітини може визначити, що це за клітина, скільки різних видів клітин є у зразку та навіть розділити їх в окремі пробірки1. Після прочитання визначення одразу виникає чимало запитань. Як клітини відрізняються? Звідки в них маркери, якщо в тілі немає магазину канцтоварів? Як змусити клітини розташовуватися окремо? Їх потрібно фотографувати і аналізувати фотографії? Нумо з’ясовувати!
Чому клітини різні?
Клітина — це структурно-функціональна одиниця всіх організмів. Вона оточена мембраною, може підтримувати стале внутрішнє середовище (за допомогою метаболізму) та розмножуватись2. Перші живі організми були одноклітинними: одна клітина могла виконувати всі необхідні функції для підтримання свого життя. Проте в процесі еволюції клітини навчилися співпрацювати, розподіляти між собою завдання та змінюватись, щоб ефективніше їх виконувати. Такі зміни і призвели до того, що тепер у нас так багато абсолютно не схожих клітин (Рис. 1). Навіть з вигляду можна здогадатись, що вони мають дуже різні функції.
Рис. 1. Різні типи клітин людського організму.
Візуально клітини можуть відрізнятись за розміром, формою, зернистістю (кількістю різноманітних включень). Як приклад можна розглянути імунні клітини крові (Рис. 2). Гранулоцити (нейтрофіли, базофіли, еозинофіли) великі за розміром і мають велику кількість гранул (в них містяться ферменти для знищення поглинутих ворогів), моноцити також великі, але не мають таких включень, а лімфоцити маленькі й без включень3,4.
Рис. 2. Різні за формою та розміром лейкоцити.
А як змусити клітини стояти поодинці, щоб побачити цю різницю?
Як розлучити клітини?
Якби ми досліджували зразок крові під мікроскопом, велика щільність клітин не становила б проблеми. У такому дослідженні ми розмастимо маленьку крапельку крові тонким шаром на предметному скельці. Клітини рівномірно розташуються, і ми зможемо впізнати і великі гранулоцити, і крихітні лімфоцити за їхнім виглядом.
Коли ж зразок клітин аналізує прилад, потрібно, щоб він міг побачити їх і розпізнати, а якщо вони «триматимуться за руки», машина просто не зрозуміє, що це. Тут в пригоді стає гідродинамічне фокусування.
Звучить складно, але уявити це досить легко. Щоб не розхлюпати воду, коли переливаємо її у вузьку посудину, ми користуємось лійкою. Та неможливо зробити лійку настільки вузькою, щоб вмістити лише одну клітину. Тому натомість використовують інший потік рідини, який рухається дуже швидко і під більшим тиском, а суспензія клітин подається дуже повільно. Цей швидкий зовнішній потік рідини ніби стискає з усіх сторін потік суспензії з клітинами (тому він називається обтискаючим) і звужує струмінь до товщини однієї клітини4. (Рис. 3)
Тепер, коли клітини вишикувались, як на шкільній лінійці, як їх розгледіти?
Рис. 3. Гідродинамічне фокусування струменю клітин. Без гідродинамічного фокусування клітини рухаються хаотично (a). Рідина, що подається під тиском стискає струмінь досліджуваних клітин і вони починають рухатись по одній (b).
Дзеркальна кімната з лазерним шоу
Коли клітини розділяються, вони по одній проходять через промінь лазера (Рис. 4).
Рис. 4. Протокова рідина під тиском змушує клітини проходити через лазерний промінь по черзі. Лазер освітлює клітину, й реєструється пряме та бічне розсіювання світла.
Проходячи через промінь, вони розсіюють світло (світлові промені змінюють свій напрямок). Пряме розсіювання світла (FSC) дає уявлення про розмір клітини. Це можна порівняти з тінню — посвітивши перед стіною на слона і на мишу, можна з’ясувати, якого вони розміру, навіть не дивлячись на тварин. Бокове розсіювання (SSC) — це заломлення світла внутрішніми структурами клітини, і саме воно допомагає зробити висновки щодо зернистості: що більше в клітині гранул, то більше променів вдарятимуться у них і заломлюватимуться. (Рис. 5)
Рис. 5. Світло лазера проходить через клітину і клітина змінює напрям світлових променів. Промені, які розсіюють світло прямо — відображають розмір клітини, а промені які відбиваються під кутом — показують наскільки зерниста клітина всередині.
Отже, якщо всі клітини по одній пройдуть через промінь лазера, ми знатимемо:
— загальну кількість клітин;
— розмір кожної клітини;
— зернистість кожної клітини.
А тепер згадаймо про імунні клітини крові із другого розділу: гранулоцити (великі й гранульовані, моноцити (великі й негранульовані) і лімфоцити (маленькі негранульовані). Ми зможемо визначити їх лише за цими двома параметрами та навіть візуалізувати. Якщо ми зробимо графік, де на осі X позначимо розмір клітини, а на осі Y її зернистість, і однією точкою в цій осі координат позначимо одну клітину, то побачимо, що точки правій верхній частині відповідатимуть гранулоцитам — великий розмір та зернистість, а точки внизу та ближче до центру — лімфоцитам, з дещо меншим розміром та низькою зернистістю4. (Рис. 6)
Рисунок 6. Графік протокової цитометрії: точковий графік розміру клітини (пряме розсіювання, FSC) проти зернистості (бічне розсіювання, SSC). Кожна точка графіку — окрема клітина. Відмінності в розмірах клітин і зернистості визначають характерне розташування різних популяцій клітин.
Така інформація може бути дуже інформативною в сфері медичних досліджень, оскільки аномальна кількість певних імунних клітин в організмі може вказувати на характер захворювання й давати підказки для діагностики та лікування.
А якщо клітини, які ми хочемо дослідити, дуже схожі між собою? Наприклад, і нейтрофіли, й еозинофіли належать до гранулоцитів: вони великі та зернисті. Як їх ідентифікувати?
Як розрізняти схожі клітини?
В одному відео про протокову цитометрію клітини вдало порівняли з фруктами в корзині супермаркету, а протоковий цитометр — з касою. Деякі фрукти можна візуально відрізнити, тоді як інші дуже схожі ззовні (як от апельсини та грейпфрути). Як їх розрізнити, якщо не можна розрізати і скуштувати кожен? В супермаркеті на допомогу приходять штрих-коди, які можна просто просканувати і не псувати комусь вечерю. Відео, до речі, можна глянути тут5.
А як щодо клітин? Навіть якщо зробити такі маленькі штрих-коди, щоб приклеїти їх на клітину, нам потрібно спершу ідентифікувати її, а якщо ми її ідентифікуємо під мікроскопом, то немає сенсу використовувати протоковий цитометр. Це замкнуте коло допомагають розірвати антитіла.
Антитіла — це агенти, натреновані, щоб знаходити свою конкретну ціль — антиген. Антитіла потрібні для боротьби з чужорідними організмами. Коли імунна клітина спіймає одну бактерію, вона розбирає її на частинки (антигени) і показує іншим клітинам, які створюють антитіла проти них (як пошукові собаки натреновані знаходити наркотики). Тобто не потрібно шукати кожну клітину самотужки, ми просто додаємо в суспензію антитіла, і вони самі, наче детективи, знаходять і прикріплюються до необхідних клітин6.
Але ж ми досліджуємо людські клітини. Тоді звідки взяти антитіла до них? Науковці вже навчились створювати антитіла проти величезної кількості антигенів, тому медичні та науково-дослідні установи можуть замовити їх з такою ж легкістю, як ми замовляємо одяг в інтернеті. Тут найголовніше — обрати правильні антитіла. Антигеном-ціллю може бути один із десятків тисяч білків на поверхні клітини. Але треба обрати найбільш унікальний білок, якого не буде в інших клітин. Уявіть, що вас пограбували, і ви можете описати лише одну рису, за якою шукатимуть злочинця. Якщо згадаєте карі очі, навряд це допоможе спіймати зловмисника, а от шрам на лобі у формі блискавки, найімовірніше, дозволить значно звузити коло підозрюваних.
Як змусити антитіла сяяти?
Отже, ми можемо підібрати унікальні антитіла до будь-якої клітини, яка нас цікавить. Але вони ще менші за саму клітину, і їх ми не побачимо й поготів. Для цього до антитіл прикріплюють флуоресцентні мітки (маркери).
Флуорофори (або флуорохроми) — це молекули, які при дії світла збуджуються і теж випромінюють світло. Таку реакцію для різних флуорофорів запускається світлом різної довжини хвилі, і випромінювати вони можуть теж світло лише конкретної довжини хвилі. На першому етапі флуорофор поглинає світло. Далі це світло збуджує електрони флуорофору. А на третьому етапі флуорофор сам випромінює дещо змінене світло. (Рис. 7)
Рис. 7. Принцип роботи флуорофора. 1. Флуорофор поглинає світлову енергію певної довжини хвилі. 2. Поглинання світла призводить до збудження електронів флуорофора. 3. Флуорофор повторно випромінює поглинуту світлову енергію на довшій довжині хвилі.
А якщо ми захочемо дізнатися про два різних види клітин, ми оберемо два несхожих флуорофори, і один буде світитись, наприклад, блакитним кольором, а інший — червоним. Тоді буде важко їх переплутати4. А що робити далі з цим світлом?
Дзеркальна кімната для світла
Світло різних довжин хвиль, яке випромінює промаркована клітина, проходить через ряд дзеркал, які можуть відбивати лише світло певної довжини хвилі, а інші — пропускати далі. Вони діють за принципом фільтрів для води: перший затримує лише тверді часточки, а решту пропускає, другий видаляє солі важких металів, третій затримує бактерії. Те саме — з дзеркалами для світла: перший пропускає все світло, а блакитний відбивається в цьому дзеркалі й потрапляє на датчик, наступний фільтр пропускає все світло, крім зеленого, і так — поки не розділимо все світло.
А тепер зберемо повну картину проточного цитометра:
- Маркуємо клітини антитілами з флуоресцентними мітками до тих клітин, які хочемо дослідити.
- Протоковою рідиною звужуємо струмінь суспензії клітин, щоб вони проходили через світло лазера по одній.
- Ми отримуємо розсіювання світла, що інформує про розмір і зернистість кожної клітини. А ті клітини, до яких причепились антитіла з флуоресцентними мітками, починають випромінювати світло.
- Світло різних довжин хвиль проходить через дзеркала, які відбивають світло одного кольору, але пропускають далі світло інших кольорів.
- Спалах світла фіксують детектори.
- Отримуємо результати з загальною інформацією про всі клітини та детальною інформацією про ті, які ми фарбували, й аналізуємо дані.
Рис. 8. Всі етапи протокової цитометрії.
Сфери застосування: від сортування сперми до підбору донора для трансплантації
Як використовують інформацію, отриману за допомогою протокової цитометрії? Дані можна застосовувати і в наукових дослідженнях (наприклад, вивчати, що відбувається з клітинами при різних захворюваннях), і в оцінюванні ефективності нових препаратів (спостерігати, як клітини реагують на нього). А в медицині це одна з найважливіших методик для імунологів, онкологів та хірургів, що проводять трансплантацію органів.
Так, наприклад, можна моніторити Т-лімфоцити в людей, які борються з ВІЛ-інфекцією. Вірус імунодефіциту людини вражає саме їх, і якщо хворобу не ідентифікують на початкових стадіях та не лікують, ВІЛ проникає в клітини і розмножується, а кількість Т-лімфоцитів у крові поступово знижується пропорційно до прогресування хвороби. Якщо людина починає антиретровірусну терапію, оцінювання кількості клітин може показати ефективність лікування і допоможе скоригувати дозу препаратів7.
Ще одне застосування проточна цитометрія знайшла в репродуктивній медицині. За допомогою флуоресцентних барвників можна маркувати та розділяти сперматозоїди з X- та Y-хромосомою. Після такої процедури батьки з більшою ймовірністю (74%) можуть зачати дитину бажаної статі та уникнути захворювань, які передаються по батьківській чи материнській лінії8,9.
Також протокова цитометрія широко застосовується для досліджень перед та після трансплантації органів та кісткового мозку. Перед операцією медиків цікавить, чи антигени на поверхні клітини донора такі самі, як антигени реципієнта. Що більше вони схожі, то менше імунна система реципієнта атакуватиме незнайомий орган. Відповідно, меншим буде ризик відторгнення пересадженого органа. А опісля моніторинг антитіл у реципієнта допомагає з’ясувати, чи організм не збирає армію антитіл, щоб знищити чужорідний пересаджений орган. Якщо таких антитіл багато, посилюється імуносупресивна терапія: пацієнт приймає препарати, щоб тимчасово пригнічувати імунну систему10.
