«Ми пасуємо одне одному, як фермент субстрату» — один з найкращих компліментів, які можна отримати від біохіміка. Фермент і субстрат — як Ромео і Джульєтта, Бонні й Клайд молекулярного світу. Їх тягне одне до одного, і без перебільшень можна сказати, що без ферментів життя було б неможливим. Як вони працюють? Хто проводить мотиваційні курси молекулам?
Хліб, вино та Нобелівські премії
Люди використовують ферментативні процеси з незапам’ятних часів. Приготування хліба, вина, сиру, обробка шкіри — все це було б неможливим без ферментів. Таке застосування було емпіричним: іноді інтуїтивним, іноді випадковим, а іноді — шляхом спроб та помилок.
Одна з найдавніших знахідок, що свідчить про виготовлення людьми ферментованих напоїв — глиняні посудини, черепки яких були знайдені на території сучасного Китаю. Аналіз органічних речовин, які ввібрали стінки цих посудин, вказує на те, що в них зберігались ферментовані напої з рису, меду та фруктів, а радіовуглецевий метод показав, що найдавніші з таких посудин належать до епохи неоліту і датуються 7000–6600 роками до нашої ери. Ба більше, дослідження посуду цієї місцевості показує, що наступні 5 тисяч років виробництво ферментованих напоїв постійно вдосконалювалося: наприклад, до напоїв стали додавати гриби для розщеплення полісахаридів до цукрів1.
Такі емпіричні знання століттями накопичувались і передавалися з покоління в покоління, проте їм бракувало фундаментальності. Навіть у XVII–XVIII століттях інформація про ферменти обмежувалася рецептами та поодинокими спостереженнями, що слина перетворює крохмаль на цукор, а шлунковий сік може розкладати м’ясо.
На фоні поступового вдосконалення практичного використання ферментів історія їх наукового дослідження виглядає трохи нелогічною. Перший фермент відкрили в 1833 році: французький хімік Ансельм Пайєн виділив діастазу, яка пізніше виявилася сумішшю ферментів, що розщеплюють складні вуглеводи (крохмаль, глікоген) до простих цукрів. Проте тоді термін «фермент» ще не існував, його введе через 44 роки Вільгельм Кюне. Кюне бере за основу латинське слово «fermentatio», що означає кипіння, і називає ферментами хімічні речовини живих організмів, що стимулюють перетворення виноградного соку на вино, оскільки під час цього процесу виділяються бульбашки, як під час кипіння. Дещо пізніше був запропонований ще один термін — «ензим», що з грецької перекладається як «у дріжджах», він вже означає хімічні речовини, що здійснюють перетворення й поза живими організмами (зараз обидва терміни вживаються як синоніми)2,15.
Навіть такий талановитий науковець як Луї Пастер, який подарував світу пастеризацію, не зміг розгадати таємницю ферментів і помилково дотримувався думки, що перетворення цукру на спирт здійснювала саме «життєва сила» дріжджів. Остаточний кінець такому віталістичному погляду поклали експерименти Едуарда Бюхнера, які показали, що навіть екстракт з неживих дріжджів має ферментативні властивості. За це дослідження Бюхнер отримав Нобелівську премію з хімії у 1907 році2.
Відтоді ензимологія впевнено віддаляється від теорій про містичні життєві сили й у XX столітті стає надзвичайно плідною справою. Дослідження ростуть, наче гриби після дощу: відкриття структури, нових ферментів, , додаткових речовин, що входять до їхнього складу. Разом з цим, ензимологія — справа надзвичайно вдячна. У 1929 році Артур Гарден та Ганс фон Ейлер-Гельпін отримують Нобелівську премію за дослідження ферментації цукру і ферментів бродіння3. У 1946 році Джеймс Самнер отримує Нобелівську премію з хімії за відкриття явища кристалізації ферментів: він першим кристалізував уреазу, пепсин, трипсин та хімотрипсин. Виявилося, що всі ферменти — це білки. Інші два тогорічні лауреати отримують Нобелівську премію також за дослідження білків, вони вперше змогли виділити вірусні білки4. Наступне відкриття структури білків принесло Максу Перуцу та Джону Кендрю Нобелівку у 1962 році, а всьому науковому світу — розчарування5. Дослідники сподівалися, що структура білків буде приблизно однаковою, проте виявилося, що кожен білок має унікальну форму, а це означало, що роботи ще непочатий край.
Джон Воркап Корнфорт у 1975 році отримує половину Нобелівської премії за дослідження стереохімії реакцій ферментативного каталізу6. Зараз вже відкрито понад 3000 різних ферментів, досліджені їхні структури, функції, та особливості реакцій, які вони каталізують. Але ензимологія досі не стала прочитаною книгою для людства8. Останню Нобелівську премію за дослідження в галузі ензимології присвоїли американським дослідникам Френсіс Арнольд та Джорджу Сміту і британському вченому Ґреґорі Вінтеру а 2018 році. Цим науковцям вдалося провести першу спрямовану еволюцію ферментів. Цей метод використовує мутації в ДНК, які спричиняють утворення більш ефективних ферментів, далі ці мутовані гени переносять у бактерії, які продукують такі ферменти 2.0. Ферменти, вироблені за допомогою цього методу, можна використати для вдосконалення виробництва різноманітних продуктів: від біопалива до лікарських препаратів7. То що таке ферменти, які принесли світу стільки смачних продуктів, наукових суперечок і Нобелівських премій?
Вибачте, але буде хімія
Живі організми завжди намагаються підтримувати стан рівноваги всередині, це називається гомеостазом. Нам завжди потрібно поповнювати запаси води, поживних речовин, отримувати з них енергію, використовувати її, виводити продукти обміну і знову поповнювати запаси. Але світ мінливий, тому це скоріше баланс на тоненькому канаті над розбурханим морем в розпал шторму, ніж спокійне урівноваження терезів. Більшість реакцій в організмі можуть відбуватися самі, але так повільно, що ми не встигатимемо реагувати на зміни середовища довкола і втратимо баланс від першого пориву вітру. Тут і приходять на допомогу ферменти.
Проте варто почати з того, що таке каталізатори. У хімії каталізатори — це речовини, які пришвидшують хімічні реакції, але самі залишаються незмінними після її закінчення. Якщо, наприклад, змішати порошок йоду й алюмінію, вони можуть днями лежати без змін, але варто додати краплю води — і вони миттєво починають реагувати, внаслідок чого утворюється нова хімічна речовина, йодистий алюміній. Води в складі цієї речовини немає, але вона, як Купідон, допомогла нерішучим йоду та алюмінію провзаємодіяти.
Та чому деяким речовинам потрібна така мотивація? Щоб молекули почали взаємодіяти, їм необхідний мінімальний запас енергії — енергія активації. Так вони долають енергетичний бар’єр, який не дозволяє хаотично взаємодіяти всім речовинам. Енергетичний бар’єр зумовлений силами відштовхування між молекулами, а також силами зчеплення між атомами всередині молекули. Тобто коли атоми в молекулі міцно з’єднані між собою, потрібно багато енергії, щоб розірвати ці зв’язки, почати реакцію й утворити нові зв’язки. На рисунку синьою стрілкою показано, скільки енергії необхідно, щоб почалася хімічна реакція, чорна крива показує реакцію без каталізатора, а зелена — реакцію з каталізатором. Як бачимо, для початку реакції з каталізатором потрібно набагато менше енергії. Чому? Каталізатор створює для субстратів перехідний стан, в якому зв’язки всередині молекули можуть легше розриватись, це і знижує енергію активації.
Хімічну реакцію можна порівняти з мандрівкою в гори: щоб спуститись до потрібної долини, група повинна спочатку піднятись на високу гору, а для цього потрібно багато енергії. Як можна збільшити кількість вільної енергії? Нагріти речовини або збільшити тиск. Тоді легко подолати енергетичний бар’єр і вступити в реакцію. Каталізатор у цій мандрівці це досвідчений гід, який просто знає короткий шлях, знижує енергію активації, переводить мандрівників з меншими витратами енергії. Хімічні каталізатори не специфічні, і справжня магія починається, коли природа створює біологічні каталізатори для кожної конкретної реакції, яка необхідна для організму2,9.
Чоботи-скороходи для хімічних реакцій
Ферменти — це біологічні каталізатори, які пришвидшують хімічні реакції в організмі. Тобто такі собі чоботи-скороходи, пошиті конкретно на вашу ногу, які допоможуть бігти в сотні мільйонів раз швидше. Ферментативні каталізатори пришвидшують реакції в цілих 108-1020 разів! Така швидкість реакцій допомагає нам миттєво реагувати на пішохода, що вибіг на червоне світло, відсахнути руку від гарячої чашки, не заціпеніти взимку, коли вибігаєш на балкон за шкарпетками (нервові імпульси між синапсами також передаються за допомогою хімічних реакцій). Метаболізм, синтез структурних елементів клітини, відновлення пошкоджених ДНК — жодна реакція в організмі не відбувається без допомоги ферментів8.
Головна функція ферментів — прискорення перетворення однієї речовини на іншу. Вихідну речовину, які потрібно змінити, називають субстратом, а кінцеву — продуктом реакції. Продукт реакції — це та речовина, яку потрібно отримати організму із субстрату. Як це відбувається?
За хімічною природою ферменти — це білки. Як і всі білки, вони складаються із довгих ланцюжків амінокислот, які щільно скручуються й упаковуються для компактності. Ферменти в десятки разів більші, ніж субстрати.
Фермент приєднується до субстрату не у випадковому місці, а в спеціальній ділянці — активному центрі ферменту. Тут і відбувається вся магія. Фермент може нейтралізувати негативні заряди, щоб дві молекули, які повинні провзаємодіяти, не відштовхувались. Він може згинати молекули так, щоб потрібні зв’язки стали доступнішими, або локально створити більш кислотне чи лужне середовище. І коли дві молекули опиняються в ідеальних для знайомства умовах, вони зрештою можуть провзаємодіяти: розірвати старі зв’язки й утворити нові, саме такі, які потрібні нашому організму. Ферменти допомагають молекулам, які у звичайних умовах ігнорують одна одну, нарешті вступити в реакцію10.
Ключі, замки та рукавички
Фермент ідеально підходить до свого субстрата. Першою моделлю такої взаємодії між ферментом і субстратом була «ключ-замок», яку запропонував Еміль Фішер у 1894 році. Ця теорія припускала, що ферменти зв’язуються зі своїми субстратами завдяки жорсткій просторовій відповідності субстрата та активного центру фермента. Тут він проводить аналогію із замковим механізмом, де субстрат — це ключ, а активний центр фермента — це замок. Якщо вони підходять одне одному, то утворюється ферментосубстратний комплекс, в якому перебудовуються молекули субстрата і відбувається реакція, в якій утворюються нові речовини – продукти реакції. Після закінчення реакції продукти від’єднуються від активного центру фермента, і туди знову може прикріпитись новий субстрат.
Модель Фішера красива й елегантна, але з появою нових даних виявилося, що декілька ключів можуть підходити до одного замка, тому його модель була доповнена у 1958 році гіпотезою вимушеної відповідності Деніела Кошленда, або, як ще її назвали, модель «рука-рукавичка». Згідно з цією гіпотезою, фермент — це не жорсткий замок, а м’яка і гнучка рукавичка, яка, зустрівшись з рукою, дещо змінює свою конфігурацію під впливом руки-субстрата. Але незалежно від того, чи ключ-замок, чи рука-рукавичка, загальна схема ферментативної реакції залишається незмінною:
фермент + субстрат → ферментосубстратний комплекс → фермент + продукт
У самурая немає цілі, є тільки шлях. Метаболічний шлях.
Що відбувається, коли організм створив спеціальний фермент, транспортував до нього субстрат, використав енергію для перетворення і нарешті отримав довгоочікуваний продукт реакції? Невже він буде задоволений собою і спокійно вирішить відпочити, насолоджуючись плодами своєї праці? Звісно, ні. Дуже рідко однієї ферментативної реакції буває достатньо, щоб отримати потрібний результат. Багато ферментативних реакцій відбуваються одна за одною: продукт першої реакції стає субстратом для другої, а продукт другої стає субстратом для третьої. Сукупність таких реакцій називається метаболічним шляхом.
Метаболічний шлях — це довгий ланцюжок біохімічних перетворень, у якому продукт однієї реакції стає субстратом для іншої. Так речовини перетворюються з максимальною енергетичною вигодою. Щоб краще це зрозуміти, можна згадати гліколіз, про який раніше писали тут. У гліколізі молекула глюкози не згорає миттєво, інакше велика частина енергії розсіювалася б як тепло. У кожній реакції гліколізу молекула глюкози розщеплюється поступово, й енергія від такого розщеплення дбайливо запасається. Метаболічні шляхи працюють і в зворотну сторону, коли молекули не розщеплюються для отримання енергії, а, навпаки, синтезуються. Такий процес також здійснюється за допомогою ферментів.
А що якщо, наприклад, батарейка зарядилася до максимуму і нам не потрібно більше розщеплювати глюкозу, або вже насинтезували достатньо нуклеїнових кислот чи білків? Як зупинити ферментативну реакцію?
Де у ферментів стоп-кран?
Щоб робота ферментів швидко підлаштовувалась до потреб клітини й була максимально ефективною, їхню активність потрібно регулювати. Тому клітина має багато способів, щоб активувати чи деактивувати ферменти. Один з таких методів — компартменталізація. Це розділення різних метаболічних шляхів по різних компартментах (частинах клітини). Ферменти гліколізу розщеплюють глюкозу клітини, а дихальний ланцюг працює в мітохондріях. Так один процес не заважає іншому, а клітина знає, куди надсилати вказівки.
Крім того, за потреби можна змінювати швидкість біохімічних процесів шляхом зниження чи підвищення постачання субстратів у клітину або синтезувати більше чи менше самого ферменту. Але один з найцікавіших, на мою думку, способів регуляції ферментативних реакцій — це алостерична регуляція (грец. allos — інший + stereos — твердий, міцний).
Алостерична регуляція передбачає, що в метаболічному шляху є алостеричний фермент, який не лише виконує свої функції на конвеєрі, а й має регуляторну ділянку, до якої можуть приєднуватись сигнальні речовини і призупиняти чи навпаки ініціювати реакцію. Зазвичай алостеричним ферментом є перший фермент метаболічного ланцюга. Ефектор — це сигнальна молекула, яка приєднується до алостеричного ферменту, через це фермент змінює свою форму і ферментативна активність підвищується або знижується. Ефектором часто може бути продукт останньої реакції метаболічного ланцюга8,11.
Щоб краще це зрозуміти, можна уявити, що ланцюжки ферментативних реакцій працюють, як конвеєр на заводі. Хтось один нарізає хліб, наступний намазує його маслом, хтось далі виставляє сир, інший — ковбасу. Якщо кожен займається лише своїм маленьким завданням, швидкість готування бутербродів зростає. Алостеричний фермент тут — це бригадир, який не лише нарізає хліб, а й може отримати вказівку від начальства або самостійно ухвалити рішення про зупинку процесу. Так, коли готових бутербродів стає багато, то бригадир це бачить і зупиняється, а через нього зупиняються й усі інші.
Також активність ферментів можна регулювати за допомогою інгібіторів, які зв’язуються не з алостеричним, а з активним центром і фізично не дозволяють це зробити субстрату. Також інгібітори можуть просто змінити форму фермента, і він втрачає здатність зв’язуватися з субстратом. Інгібіторами можуть бути речовини в самому організмі (наприклад, метаболіти) або ж поза ним (ліки або отрути)12.
До речі, про ліки
У дитинстві мені запам’яталась реклама препарату, де люди після застілля приймали таблетки, щоб не відчувати важкості в шлунку. Я була впевнена, що від такої кількості їжі в шлунку там утворюються затори, і ці маленькі рожеві таблетки просто перетягують їжу далі в живіт. Дитяча уява знайшла просте пояснення, але як виявилось пізніше, все набагато цікавіше.
То був один із численних препаратів, який вміло опанував стихію ферментів і спрямував її в корисне русло. Це приклад одного з найпростіших способів використання ферментів у медицині: ферменти тварин (у цьому випадку — травні підшлункової залози) використовують як додаткове джерело необхідних людині каталізаторів, які розщеплюють їжу у тонкому кишківнику.
Також часто застосовують не самі ферменти, а їхні інгібітори, щоб призупинити ферментативні процеси. Так, деякі антибіотики діють як інгібітори ферментів патологічних бактерій, які не дозволяють бактеріям будувати свою клітинну стінку, синтезувати нуклеїнові кислоти або білки2.
Ще одне застосування знань з ензимології — у клінічній діагностиці. Найчастіше досліджують ферменти сироватки крові. З найвідоміших — та , підвищення яких може свідчити про пошкодження клітин печінки, а підвищення ферменту — про ураження серця та скелетних м’язів. Деякі ферменти можуть бути навіть маркерами пухлин. Наприклад, є NSE (нейрон-специфічна енолаза) — фермент гліколізу, який в нормі перебуває в клітинах нейроендокринного походження. Під час масового руйнування таких клітин або онкологічних процесів цей фермент виходить у кров’яне русло, і можна раніше діагностувати хворобу13,14. Також багато ферментативних реакцій лежать в основі діагностичних наборів для проведення аналізів, а в промисловості ферменти стали незамінним компонентом багатьох процесів, для опису яких знадобиться ціла окрема стаття.
Ензимологія — одна з наук, яка не лише пролила світло на біохімічні процеси в організмах, а й стала надійною помічницею для людини в багатьох сферах життя. Можливо, навіть тих, що й не очікуєш. Коли мені сумно через те, що життя наче застигло на місці, я згадую про ці чарівні каталізатори, що роблять його швидшим і кращим.
