25 липня 2019 року виповнюється сорок один рік Луїзі Браун – першій у світі людині, народженій за допомогою методу штучного запліднення. Цей день прийнято вважати професійним святом ембріологів – фахівців зі штучного запліднення. Технології невпинно рухаються, що дозволяє постійно вдосконалювати методи у цій галузі, зокрема редагувати генетичний матеріал, щоб убезпечити майбутню дитину від мітохондріальних хвороб.
Чи можете ви уявити себе дитиною трьох біологічних батьків? Плануючи сім’ю і дітей, сьогодні люди у деяких країнах світу можуть залучати третю особу у процес «створення» дитини. Це не означає, що пара має долучитися до клубу свінгерів чи любителів робити «це» втрьох. Отримати дитину трьох батьків за допомогою природного зачаття неможливо. Проте є можливість звернутися до спеціалістів, які за допомогою ядерних переносів із залученням жінки-донора, зроблять її фактично другою біологічною матір’ю для майбутнього малюка.
Для чого це потрібно?
Хоч це все і звучить як щось далеке і химерне, але у червні 2016 року вчені з університету Ньюкасл, що у Великобританії, здійснили прорив у галузі дослідження мітохондріального трансферу – технології, що дозволяє жінкам з мітохондріальними захворюваннями мати здорових дітей, замінивши власні в яйцеклітині на донорські.
Генетична інформація організму закодована не лише в ядерній ДНК, що містить спадкові дані як матері, так і батька, певна частка геному захована в мітохондріях. Ядерна ДНК має до 20000 генів, що відповідають за все, починаючи від визначення кольору очей і закінчуючи схильністю до розвитку алкоголізму. Мітохондріальна ДНК (м-ДНК) містить тільки 37 генів, які мають життєво важливе значення для нормального функціонування мітохондрій і успадковуються лише по материнській лінії. Проте, якщо мітохондрії мають генетичні, структурні чи біохімічні дефекти, це стає причиною виникнення мітохондріальних захворювань – спектру хвороб, спричинених дисфункцією мітохондрій. До таких захворювань належать серцево-судинні захворювання, цукровий діабет, глухота, певні форми раку та деякі типи чоловічого безпліддя. Так, якщо жінка має мітохондріальну хворобу, вона неодмінно передасть її дітям разом зі своєю м-ДНК.
Вчені знайшли спосіб удосконалити , а саме: як збільшити кількість життєздатних зигот і зменшити число дефектних мітохондрій, що передаються разом із ядерною ДНК в клітини донора.
Та поки світова наукова спільнота, комісії з питань біоетики, психологи та юристи палко дискутували та обговорювала усі «за» і «проти» цього методу, українські вчені шокували не менше. У червні того ж 2016 року вони оголосили, що двоє українок на той час уже виношували дітей трьох батьків, створених за допомогою технології штучного запліднення – пронуклеарного трансферу. У січні 2017 року в Україні народилася перша абсолютно здорова дитина (дівчинка), що генетично має трьох батьків.
Ми обігнали британців, які обігнали нас
Павло Мазур – лікар-ембріолог клініки репродуктивної медицини «Надія», член української команди лікарів та науковців, що працював над створенням дитини трьох батьків. Моторний, веселий, з сережкою у вусі він запрошує до лабораторії та дає максимально відкриті й розгорнуті відповіді на складні питання щодо нової технології.
«Метод перенесення пронуклеусів не є новим, йому близько 30 років. Спочатку технологія ядерного трансферу потрібна була винятково для лікування мітохондріальних захворювань. Існує декілька типів переносу ядер. Перший – перенесення метафазної пластинки. Цей метод не приніс значних успіхів. Протягом багатьох років кропіткої праці доктор Шухрат Міталіпов успішно проводив досліди на приматах, але до клінічних досліджень за участю людей справа так і не дійшла.
Інший спосіб – перенесення гермінального везикула, тобто ядра дуже незрілого на стадії профази першого , коли у нього візуалізується одне ядро, де розташований повний набір хромосом. Це ядро можна перенести в донорську клітину, але складність процедури полягає у тому, що далі потрібно проводити in vitro maturation, тобто подальше дозрівання клітини у лабораторних умовах, що є доволі новою технологією з нестабільними і відносно низькими показниками успішності (частота настання вагітності без маніпуляцій з ядрами здебільшого менша за 35%). Тому цей метод теж відпадає.
Звісно, є ще перенесення другого полярного , яке може бути використане як жіноче гаплоїдне ядро, тобто з половинним набором хромосом (23 хромосоми). Ця методика стовідсотково працює на мишках, але не на людях. Хоча експерименти і показують, що друге полярне тільце перетворюється на повноцінне ядро і відбувається формування ембріона.
І ось, нарешті, наше основне питання – пронуклеарне перенесення ядер. Зигота (ембріон першого дня) має два ядра до сингамії – злиття ядер, кожне з яких має . Чоловіче ядро отримується напряму зі сперматозоїда, в той час як жіноче формується під час мейозу і внаслідок викиду другого полярного тільця. До сингамії в зиготі існують два окремі ядра. Основний принцип методики пронуклеарного трансферу – взяти оці два гаплоїдні ядра і перенести їх в донорську , яка, відповідно, є попередньо очищеною від своїх власних ядер. Так і відбувається заміна мітохондрій, однак, некоректно говорити про заміну лише мітохондрій, бо в цитоплазмі містяться всі органели клітини.
Яйцеклітина, ооцит, а згодом і зигота – абсолютно унікальна клітина, яка має все необхідне для розвитку ембріона протягом перших 3-4 днів, до включення власного геному. Протягом перших трьох днів розвитку ембріон дробиться, і його власний геном є неактивним. Тому всі важливі речовини та матричні РНК ооцитами «запасають» задовго до запліднення. Після запліднення запускається своєрідна програма: поїзд зривається з гальм і їде лише вперед, без зупинки, і зворотного шляху для нього вже нема. Тому все те, що було накопичене ооцитом, власне і визначає якість ембріона та потенціал реалізації генетичного матеріалу.
Основна різниця між нашими і британськими дослідженнями полягає в тому, що вчені з Ньюкасла зосереджені на заміщені мітохондрій, які є тригером ряду захворювань, ми ж маємо на меті трансфер цитоплазми як єдиного цілого. Технології дуже схожі між собою, практично ідентичні, хоча ми йшли абсолютно незалежно одне від одного. Я вражений тим, наскільки наші методики схожі, незважаючи на те, що ми працювали окремо.
Гуманні методи
Коли ядра дістають з клітини, вони оточені невеликим шаром цитоплазми. Для того щоб ядра і цей шматочок цитоплазми злилися з клітиною-донором, необхідно здійснити певні маніпуляції, бо якщо просто покладемо їх поруч, злиття в одне ціле не відбудеться. Навіть якщо намагатися застосувати грубу фізичну силу, наприклад, механічно заштовхувати ядра в цитоплазму, клітина не сприйматиме чужорідний об’єкт (ядра), і як наслідок, і ядра і цитоплазма гинутимуть.
У 2003 році американські науковці активно використовували технологію Electrofusion як метод злиття ядер з цитоплазмою, але у нашій клініці дійшли висновку, що вражати людські ооцити електричним струмом – негуманно, хоча методика і вважається цілком безпечною. Ми вирішили застосовувати іншу, більш природну техніку введення ядер у цитоплазму – використання фрагмента вірусу Сендай (Sendai virus), який, грубо кажучи, є мишачим грипом. Віріони – частинки вірусу грипу – проникають в клітину, фіксуються і починають своє внутрішньоклітинне існування. Вчені вирішили використати цей механізм входження вірусу для введення ядер. Знищивши нуклеїнову кислоту, тобто те, що забезпечує репродукцію вірусу, залишають лише оболонки вірусу з рецепторами, які сприяють злиттю . Використовуючи фрагменти вірусу Сендая, можна забезпечити входження ядер в цитоплазму донора. Даний метод має назву Cell fusion kit, саме його ми і застосовуємо, тому що це – більш природний шлях з використанням біологічного підходу задля вирішення проблеми. Ми наче заражаємо клітину ядром.
У роботі, опублікованій британцями, згадується застосування вищеописаного методу, і ми були приємно здивованні їхньою відмовою від Electrofusion. Отже, метод, застосований в Ньюкаслі, майже копіює наш, що є черговим підтвердженням теорії конвергентної еволюції – ми працювали незалежно одне від одного над тією ж самою проблемою і прийшли до дуже схожого розв’язку.
Основна відмінність – британські вчені шукають вирішення проблеми мітохондріальних захворювань, і відповідно способу заміни мітохондрій в клітині. Вони шукають хворих пацієнтів, які хочуть мати здорових дітей. Ми ж таких людей не шукаємо з однієї простої причини – в Україні взагалі не діагностують мітохондріальні хвороби. Люди просто не знають, що вони є носіями даних захворювань. У нас в країні немає жодного центру діагностики мітохондріальних хвороб. За 10 років існування клініки до нас не звернулась жодна людина з подібним діагнозом. Це, на жаль, не значить, що українці не мають таких проблем, просто вони навіть не здогадуються про таку можливість.
Тому наша головна мета різниться: ми зосереджені на випадках, коли у наших пацієнток не розвиваються ембріони. Відбувається запліднення, формується зигота, а далі відбувається або повне припинення , або клітини починають ділитися, але без утворення – ембріона п’ятого дня – кульки, утвореної з понад 100 клітин, з якої далі формується сам плід, плацента та інші складові, необхідні для подальшого повноцінного розвитку. Пацієнтки з арештом розвитку ембріона є, на жаль, безплідними і не можуть мати власних генетичних дітей за жодних умов. Тому ми зосереджені саме на даній категорії пацієнтів.
Наступна, і, мабуть, найголовніша відмінність наших досліджень від британських – підтверджений факт двох вагітностей. Ми зробили переноси реконструйованих ембріонів двом жінкам і отримали дві успішні вагітності. До цього жодна з пацієнток не мала перспективи стати біологічною матір’ю, а пронуклеарний трансфер дав їм таку можливість.
І ще трохи про мітохондрії
Хоч всім відомо, що основна роль мітохондрій – переробка енергії в клітині, повний спектр їхніх функцій і можливостей залишається недослідженим.
На мою думку, вчені з університету Ньюкасл довго не переходили на наступний рівень клінічних випробувань, тому що їх спіткала певна дилема, а саме: при виокремленні ядра з клітини невелика кількість цитоплазми, що щільно прилягає до ядер, переноситься до клітини донора. Повністю очистити ядра від цитоплазми неможливо, тому що за її повної відсутності ядра «схлюпнуться» і генетичний матеріал буквально виллється з ядер, тому навколо них завжди має бути невеликий прошарок внутрішньоклітинної речовини. Цікаво, що цитоплазма навколо ядер має високу концентрацію мітохондрій. Тобто за будь-яких умов нова клітина міститиме як материнські, так і донорські мітохондрії. Залишається тільки здогадуватися, як вони розподіляться в клітинах ембріона, і яку загрозу це може мати для нового організму.
Мітохондрії – активні органели, здатні зливатись між собою, ділитися, розходитися, та відповідно, можуть обмінюватися фрагментами ДНК. Також невідома потенційна взаємодія материнських і донорських мітохондрій, вплив ДНК донора на ДНК матері, і навпаки. Дане питання є вирішальним для тих, хто має на меті повну заміну хворих материнських мітохондрій. Ми ж, у свою чергу, шукаємо вихід для лікування безпліддя, і факт залишку материнських мітохондрій не є для нас вирішальним.
Ми схиляємося до думки, що певні процеси в цитоплазмі не дають зиготі можливості сформувати повноцінну бластоцисту. Так, шляхом заміни цитоплазми ми дозволяємо материнському генетичному матеріалу реалізуватися в межах здорового донорського ооцита. І ми знаємо, що це працює. На сьогодні для жінок з проблемою розвитку ембріона пронуклеарний трансфер – єдиний відомий спосіб мати дітей».
